Isolation bactériophage

Isolation bactériophage

Isolation bactériophage

Comme nous avons discuté en classe, bactériophage sont des virus qui infectent les bactéries (bactériophage signifie bactéries eater). Bactériophage qui infecte E. coli parfois sont appelés coliphage. En général, le bactériophage est appelé simplement phage. Comme cela est vrai pour tous les virus, le phage peut répliquer uniquement dans les cellules hôtes. En d’autres termes, le coliphage peut se répliquer uniquement dans E. coli. Phagique doit joindre à un récepteur sur la surface d’une cellule bactérienne afin d’initier une infection. Cette interaction entre le phage et le récepteur est très spécifique – un type de phage donné ne se liera à un molécule réceptrice spécifique. Ainsi, tous les phages ne se ressemblent pas.

Comme nous l’avons vu dans le laboratoire. pas tout E. coli sont similaires. Variabilité existe dans la croissance curvesand la résistance aux antibiotiques des différents E. coli isolats. On pourrait supposer que ces isolats de E. coli possèdent également certaines différences dans leurs molécules de surface et, en conséquence, des différences au niveau des récepteurs de phages présents sur les surfaces (se rappeler – ces molécules de surface servent une fonction importante pour les bactéries, ils n’existent pas sur la surface cellulaire uniquement comme des portes d’entrée pour le phage!). Pour examiner si, en fait, de telles différences de récepteurs existent, nous allons mener une expérience de lysotypage. Chaque personne va isoler un phage qui pousse facilement dans son / sa E. coli isoler. Ensuite, nous allons étudier si oui ou non chacun de ces phages isolats est capable de se répliquer dans l’autre E. coli isolats. A la fin de cette expérience, nous serons en mesure de produire un tableau qui montre la sensibilité ou la résistance de chaque personne de E. coli à chacun des isolats de phage. Chaque groupe est également encouragé à développer et mener des expériences supplémentaires avec leur phage et E. coli isole dans une tentative d’en apprendre davantage sur la diversité de ces isolats. Pour la plupart de ces expériences, votre groupe peut travailler sur son propre. Chaque personne doit cependant avoir une préparation de phages enrichi par la semaine prochaine (2 Avril ou 3).

Isolation bactériophage

Chaque personne va isoler un bactériophage spécifique pour son propre isolat de E. coli. Isoler le phage suivant les instructions fournies. Parce que la plupart des étapes sont très courtes et nécessitent 1 à 2 incubations de jour entre eux, nous ne ferons pas les procédures ensemble comme une classe. Au contraire, nous allons passer en revue les protocoles aujourd’hui. Vous pouvez effectuer l’isolement du phage selon votre propre horaire. La seule exigence est que vous complète Jour 4 dans le temps pour le laboratoire le 2 Avril ou 3.

bactériophage Obtention

Sans surprise, bactériophage peut être trouvé dans les endroits où de nombreux hôtes existent. Parce que l’utilisation de coliphage E. coli en tant qu’organisme hôte, ces phages peuvent être trouvés dans des endroits où E. coli sont abondants. Nous avons vu plus tôt dans le semestre que nous tous hébergent de nombreux E. coli (et d’autres bactéries) dans nos intestins. De toute évidence, les E. coli laisser notre corps. Ainsi, les eaux usées contient E. coli de chacun dans la ville. Et, par conséquent, les eaux usées contiennent également de nombreuses coliphage.

J’ai obtenu un échantillon d’eaux usées de l’usine de traitement des déchets Rocky River à Mooresville. De cette matière, nous allons isoler différentes souches de phage.

L’isolement du bactériophage

Jour 1: Inoculer 5 ml de bouillon de soja tryptique avec votre E. coli. Comme nous l’avons fait avant, toucher une aiguille stérile à une colonie et le transférer vers le tube de bouillon. Incuber une nuit à 37 o C.

Jour 2: Inoculer un autre tube avec 4,5 ml eaux usées, 0.5ml de votre nuit E. coli culture, et 0,5 ml de 10x bouillon de soja tryptique (ce que nous entendons par «10x tryptique bouillon de soja? Pourquoi utilisons-nous 10x TSB pour cette étape?). Incuber pendant 24-48 heures à 37 ° C. Au cours de cette incubation, le phage dans l’échantillon d’eaux usées capable de se lier à votre E. coli va répliquer et finalement lyser les bactéries. Ainsi, cette étape sert comme moyen d’amplification du phage qui peuvent infecter les bactéries.

Prendre jusqu’à 3 ml du liquide surnageant dans une seringue de 5 cc. Fixer un filtre de 0,22 micron à la base de la seringue et de filtrer le surnageant dans un tube stérile. Ce filtre empêche les bactéries restantes de passer à travers, mais permettra phages de passer à travers. Etiqueter le filtrat "Enrichi préparation de phages." Conserver au réfrigérateur.

Mettre en place une autre culture de la nuit de votre E. coli.

Jour 3: Transfert 100 microlitres d’une nuit E. coli croissance sur le centre d’une boîte de Petri de 60 mm contenant de la gélose de soja trypsique (ces plaques sera au réfrigérateur). Avec une tige de verre cintré, répartir les bactéries sur la plaque. Ensuite, placez 10 microlitres de votre phage prep enrichi dans le centre de la plaque. Incuber à 37 ° C pendant une nuit.

Jour 4: Examinez votre assiette. Parce que nous avons ajouté des milliers (ou peut-être des millions!) De bactéries à la plaque, nous ne verrons pas des colonies isolées. Plutôt une pelouse confluentes de bactéries couvrira l’agar-agar. Le phage, cependant, va infecter et tuer les bactéries dans le centre de la plaque, la création d’une région visible aucune bactérie – une plaque. Cette simple expérience démontre que vous avez isolé phage capable d’infecter votre souche de E. coli. Retourner la plaque dans l’incubateur et incuber pendant plusieurs jours. Avez-vous remarqué quelque chose d’inhabituel?

Le jour avant le laboratoire de la semaine prochaine, inoculer un tube de bouillon de soja tryptique (environ 5 ml) avec votre E. coli isoler et incuber une nuit à 37 o C.

Vous pouvez également commander ici.

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